Бактеріологічний метод дослідження.

Дізнаємось

Виявлення патогенних мікроорганізмів в патологічному матеріалі за допомогою мікроскопа називається мікроскопічним методом лабораторної діагностики.

Для мікроскопії використовують:
1. мокротиння,
2. гній,
3. кров,
4. спинномозкову рідину (ліквор),
5. сечу,
6. слиз із слизових оболонок,
7. зішкріби із уражених ділянок шкіри,
8. уражене волосся,
9. нігті,
10. відбитки уражених органів.
Здатність мікроорганізмів сприймати барвники називають тинкторіальною ( від лат. tinctura – настоянка) властивістю.


ПРЕДМЕТНЕ СКЛО.

Для виявлення мікроорганізмів у патологічному матеріалі готують мазки на предметному склі. Їх готують заздалегідь – миють, знежирюють і зберігають у етиловому спирті або суміші Никифорова ( суміш діетилового ефіру та етилового спирту 1:1) у широкогорлій банці з притертою кришкою. Перед роботою їх витирають насухо або вносять скло пінцетом у вогонь спиртівки і хімічні речовини згоряють. Тримати скло потрібно І та ІІ пальцями лівої руки за ребра.

Під час роботи із патологічним матеріалом необхідно дотримуватися правил техніки безпеки.


ЕТАПИ ПРИГОТУВАННЯ МІКРОСКОПІЧНОГО ПРЕПАРАТУ.
І. Приготування мазків.
ІІ. Висушування мазків.
ІІІ. Фіксація мазків.
ІУ. Фарбування мікроскопічного препарату.


ВИСУШУВАННЯ МАЗКІВ.

Висушувати мазки слід на повітрі. Під впливом високої температури структура мікробної клітини порушується.



ФІКСАЦІЯ МАЗКІВ

ЦІЛЬ:
1. закріплення матеріалу на склі;
2. знезараження матеріалу;
3. кращого фарбування ( вбиті мікроби краще поглинають барвники).

МЕТОДИ ФІКСАЦІЇ:
• фізичний метод – використання полум’я спиртівки;
• хімічні методи – використання різних хімічних речовин (етилового спирту, суміші Никифорова, ацетону та ін.)

Фіксують лише висушені мазки.
Фіксований мазок називають – “ мікроскопічний препарат”.
Забороняється залишати на відкритих місцях незафіксовані мазки після
закінчення роботи.
Фізичним методом фіксують мазки, виготовлені з культури мікроорганізмів, за
умови, що під час нагрівання не змінюється структура мікробної клітини.
Хімічним способом фіксують мазки, виготовлені із патологічного матеріалу, а також з культури в тому разі, коли під час нагрівання може порушитися структура бактеріальної клітини (капсульні форми бактерій, спірохети).


ФАРБУВАННЯ МІКРОСКОПІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ.

ЦІЛЬ:
Мікроби прозорі, безбарвні, для того ,щоб побачити їх у світловий мікроскоп їх фарбують.

МЕТОДИ ЗАБАРВЛЕННЯ:
• прості – використання лише однієї фарби;
• складні - використання двох і більше фарб.

Складний метод забарвлення по Граму.
За методом фарбування по Граму бактерії поділяються на 2 групи: грам позитивні (фарбуються у фіолетовий колір) та грам негативні (фарбуються у червоний колір). Різний колір забарвлення пояснюється різною будовою їх клітинної стінки. Основну частину клітинної стінки грам позитивних бактерій складає пептидоглікан – понад 90%. Він має форму сітки. У грам позитивних бактерій він утворює 5-6, інколи до 40 шарів. Коли бактерії фарбують ген ціановим фіолетовим, а потім розчином Люголю,то утворюється нерозчинний у спирті і воді комплекс йоду з барвником. Цей комплекс не вимивається спиртом і водою через слабку проникність клітинної стінки. Грам позитивні бактерії залишаються забарвленими у фіолетовий колір. Дофарбовування препарату фуксином не змінює фіолетового кольору клітин.
У грам негативних бактерій пептидоглікан утворює переважно один шар. Зрідка – два. Тому комплекс ген ціанового фіолетового з йодом легко вимивається спиртом і водою, внаслідок чого бактерії знебарвлюються. Знебарвлені бактерії зафарбовуються фуксином у червоний колір.




АЛГОРИТМ №1 “ Виготовлення мазка із в’язкого матеріалу”.


• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Покладіть скло у кришку чашки Петрі;
• Профламбуйте у вогні спиртівки бактеріологічну петлю та охолодіть її;
• Бактеріологічною петлею візьміть матеріал;
• Нанесіть бактеріологічною петлею патологічний матеріал на середину скла і круговими рухами рівномірно розподіліть на поверхні скла матеріал, утворивши круглий мазок величиною у двокопієчну монету;
• Обеззаразьте бактеріологічну петлю у вогні;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки..


АЛГОРИТМ №2 “ Виготовлення мазка із крові”.


• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова 2 предметних скла ( одне повинно бути вужчим і мати шліфований вузький кінець);
• Протріть їх насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Поставте номер у верхньому лівому куті ширшого скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Нанесіть краплю крові пастерівською піпеткою на ширше скло ближче до правого кінця;
• Поставте друге скло шліфованим кінцем у краплю крові, нахиліть його вправо під кутом 450;
• Проведіть ним по першому склу справа наліво на 3\4 скла;
• Опустіть вузьке скло в дезинфекційний розчин;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки..

УВАГА! Правильно виготовлений мазок повинен мати світло-рожеве забарвлення і бути рівномірним за товщиною.


АЛГОРИТМ №3 “ Виготовлення препарату “товста крапля””

Перший спосіб.
• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Покладіть скло у кришку чашки Петрі;
• Після посіву крові у поживне середовище для дослідження на менінгокок, нанести крапельку крові на предметне скло, доторкнувшись канюлею шприца у середині скла;
• Канюлею шприца, круговими рухами рівномірно розподіліть на поверхні скла кров, утворивши круглий мазок величиною у двокопієчну монету;
• Шприц опустіть в дезинфекційний розчин;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки;
• Висушений мазок загорнути у папір і доправити в бак лабораторію.



Другий спосіб.
• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Протерти ватною кулькою, змоченою у спирті, пучку пальця руки;
• Скарифікатором проколоти палець;
• Ватною кулькою, змоченою у спирті, стерти першу крапельку крові, яка виступила із ранки;
• Легенько доторкнутися серединою предметного скла до краплі крові, яка виступила із ранки;
• Скарифікатором, круговими рухами рівномірно розподіліть на поверхні скла кров, утворивши круглий мазок величиною у двокопієчну монету;
• Скарифікатор опустіть в дезинфекційний розчин;
• Покладіть скло із мазком у кришку чашки Петрі;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки;
• Висушений мазок загорнути у папір і доправити в бак лабораторію.






АЛГОРИТМ №4 “ Виготовлення мазка із слизу, взятого з ротоглотки (зіву) ”
• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Покладіть скло у кришку чашки Петрі;
• Ватним тампоном, яким забирали слиз, нанесіть матеріал на середину предметного скла із робліть рівномірний круглий мазок до величини 2 –копієчної монети;
• Ватний тампон обеззаражують, занурюючи у дезрозчин;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки..

АЛГОРИТМ №5 “ Виготовлення мазка із сечі, спинномозкової рідини”
• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Покладіть скло у кришку чашки Петрі;
• Профламбуйте у вогні спиртівки бактеріологічну петлю та охолодіть її;
• Бактеріологічною петлею візьміть матеріал із дна посудини;
• Нанесіть бактеріологічною петлею патологічний матеріал на середину скла і круговими рухами рівномірно розподіліть на поверхні скла матеріал, утворивши круглий мазок величиною у двокопієчну монету;
• Обеззаразьте бактеріологічну петлю у вогні;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки..
•
АЛГОРИТМ №6 “ Виготовлення мазка із бульйонної культури мікроорганізмів”.
• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Нанесіть контури майбутнього мазка;
• Переверніть скло (нанесений контур знизу);
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Покладіть скло у кришку чашки Петрі;
• Профламбуйте у вогні спиртівки бактеріологічну петлю та охолодіть її;
• Бактеріологічною петлею візьміть бульйонну культуру;
• Нанесіть бактеріологічною петлею краплю бульйонної культури на середину скла і круговими рухами рівномірно розподіліть на поверхні скла матеріал, утворивши круглий мазок величиною у двокопієчну монету;
• Обеззаразьте бактеріологічну петлю у вогні;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки..


АЛГОРИТМ №7 “ Виготовлення мазка із агарової культури мікроорганізмів”.
• Запаліть спиртівку;
• Пінцетом вийміть із суміші Никифорова предметне скло;
• Протріть його насухо ватними кульками або внесіть у вогонь спиртівки;
• Нанесіть контури майбутнього мазка;
• Переверніть скло (нанесений контур знизу);
• Поставте номер у верхньому лівому куті скла;
• Зафламбуйте скло у полум’ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
• Покладіть скло у кришку чашки Петрі;
• Профламбуйте у вогні спиртівки бактеріологічну петлю та охолодіть її;
• Бактеріологічною петлею нанесіть краплю стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду на предметне скло;
• Профламбуйте у вогні спиртівки бактеріологічну петлю та охолодіть її;
• Відкрийте лівою рукою чашку Петрі з ростом культури мікроорганізмів (колоніями);
• Візьміть бактеріологічною петлею обережно частинку однієї колонії (слід брати колонію мікроорганізмів, а не агар!);
• Закрийте чашку Петрі;
• Нанесіть бактеріологічною петлею матеріал на суху поверхню скла поряд із краплею ізотонічного розчину та розітріть;
• Круговими рухами рівномірно розмішайте матеріал із краплею ізотонічного розчину, розподіліть на поверхні скла матеріал, утворивши круглий мазок величиною у двокопієчну монету; (Мазок має бути тонким, прозорим, рівномірним, невеликим.)
• Зафламбуйте бактеріологічну петлю у вогні;
• Мазок залиште до висихання на робочому столі біля запаленої спиртівки..

АЛГОРИТМ №8 “Фіксація мазка фізичним методом”.
• Запаліть спиртівку;
• Візьміть пінцетом предметне скло із висушеним мазком;
• Внесіть предметне скло протилежною стороною від мазка тричі по 2 секунди у верхню частину полум’я спиртівки ;
• Виймаючи кожного разу предметне скло, дотокніться нижньою поверхнею скла до тильної сторони руки (перевірка правильності фіксації) – мазок повинен бути гарячим,але не обпікати руку.

АЛГОРИТМ №9 “Фіксація мазка хімічним методом”.
• Візьміть ємність із сумішшю Никифорова ( ємність має бути із широкою горловиною та закриватися притертою кришкою);
• Внесіть пінцетом висушений мазок у суміш таким чином, щоб мазок не торкався стінок та дна ємності;
• Залишіть мазок у такому положенні на 15 хвилин;
• Пінцетом вийміть за фіксований мазок і внесіть у полум’я спиртівки, щоб згоріли хімічні речовини..


АЛГОРИТМ №10 “ Фарбування мікроскопічного препарату простим
методом”.

• Помістіть підставку для фарбування над лотком;
• Помістіть препарат на підставку для фарбування;
• Нанесіть барвник (фуксин Пфейфера або метиленову синьку) піпеткою так, щоб він закрив весь препарат;
• Проконтролюйте термін дії барвника за допомогою пісочного годинника - 2 хвилини;
• Промийте препарат дистильованою водою;
• Злийте залишки води та висушіть препарат фільтрувальним папером..



АЛГОРИТМ №11 “ Фарбування мікроскопічного препарату складним методом
по Граму”.

• Помістіть підставку для фарбування над лотком;
• Помістіть препарат на підставку для фарбування;
• Покладіть на препарат папірець по Синьову (фарба генціаовий фіолетовий), змочіть його дистильованою водою – 2-3 краплі, витримайте 2 хвилини;
• Зніміть папірець пінцетом, нанесіть піпеткою розчин Люголю – на 1-2 хвилини (до почорніння препарату);
• За допомогою пінцета злийте з препарату барвник і в нахиленому положенні промийте його етиловим спиртом 960 до зникнення фіолетових хвильок барвника (30 секунд);
• Нанесіть піпеткою розчин фуксину на 2 хвилини;
• Злийте фарбу та промийте препарат водою;
• Висушіть фільтрувальним папером.

Проблемні питання

Д.з.

Доступно тільки для зареєстрованих користувачів